如何拆分双端fastq文件？

Question

我在一个 .fastq 文件中包含 Illumina 双端读取，正向读取表示为“/1”，反向读取表示为“/2”。

我正在使用 grep 提取单个读取并将它们放入 2 个相应的文件中（一个用于正向读取，一个用于反向读取。

grep -A 3 "/1$" sample21_pe.unmapped.fq > sample21_1_rfa.fq
grep -A 3 "/2$" sample21_pe.unmapped.fq > sample21_2_rfa.fq

但是，当我尝试使用文件（fastqc、程序集等）时，它们不起作用。当运行 fastqc 我收到以下错误：

 Failed to process file sample21_1_rfa.fq
 uk.ac.babraham.FastQC.Sequence.SequenceFormatException: ID line didn't start with '@'
     at uk.ac.babraham.FastQC.Sequence.FastQFile.readNext(FastQFile.java:134)
     at uk.ac.babraham.FastQC.Sequence.FastQFile.next(FastQFile.java:105)
     at uk.ac.babraham.FastQC.Analysis.AnalysisRunner.run(AnalysisRunner.java:76)
     at java.lang.Thread.run(Thread.java:662)

但是，如果您查看文件，它们的标识符确实以“@”开头。关于为什么这些文件不起作用的任何建议？我最初使用

将 .bam 文件转换为 .fastq 文件

 samtools bam2fq

以下是每个文件的样本：

合并.fastq

@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:1091:2161/1
GAGAAGCTCGTCCGGCTGGAGAATGTTGCGCTTGCGGTCCGGAGAGGACAGAAATTCGTTGATGTTAACGGTGCGCTCGCCGCGGACGCTCTTGATGGTGACGTCGGCGTTGAGCGTGACGCACG
+
B/</<//B<BFF<FFFFFF/BFFFFFFB<BFFF<B/7FFF7B/B/FF/F/<<F/FFBFFFBBFFFBFB/FF<BBB<B/B//BBFFFFFFF/B/FF/B77B//B7B7F/7F###############
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:1091:2161/2
TGACGCCTGCCGTCAGGTAGGTTCTCCGCAGATCCGAAATCTCGCGACGCTCGGCGGCAACATCTGCCAGTCGTCCGTGGCGGGCGACGGTCTCGCGGCGTGCGTCACGCTCAACGCCGACGTAC
+
/B<B//F/F//B<///<FB/</F<<FFFFF<FFBF/FF<//FB/F//F7FBFFFF/B</7<F//<BB7/7BB7/B<F7BF<BFFFB7B#####################################
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:1637:2053/1
NGTTTACCATACAACAATCTTGCGACCTATTCAAATCATCTATATGCCTTATCAAGTTTTCATAGCTTTCAAGATTCTCAATTTCCTCACGTCTCGCTTTGCTCAACCTACAAAAACTCTCTTCT
+
#<<BBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF<FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFB/BFBBFBB<<<<FFFFFFBB<FBFFBFF
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:1637:2053/2
TCGGTCGTTGGGAAAAGACCTGTGGTAAACATCCTACGCAAAAGCCATTGCGGTTACTCGTTCGTATGATTCTTGCATCAACTAATCAAGGCGATTGGGTTCTCGACCCATTTTGTGGAAGTTCG
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFBFFFFFFFFFFFFFFFBFFFFFB<FF<<BBFB
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:1792:2218/1
TCTATCGGCTGACCGATAAGCTGTCGCCTGCCGACCGTCCTGCCATGGGACGGCGCATCGCACAGCTCACCCTGGACTAACTCTCCAACACCATGATGCTGACACGCTCGGCAAAAACACCCGAT
+
<<B/<B</FF/<B/<//F<//FF<<<FF//</7/F<</FFF####################################################################################
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:1792:2218/2
TGCCGGAGGGCGTCGATGGTGGCATCGAGCTTTTTTGCCGAGCGTGTCAGCATGATGGTGTTGTAGAGATAGTCCATGGTGAGCTGTGCGATGCGCCGTTCCATGGCAGGACGGTCGGCAGGCGC
+
BBBBBFFFFFFFFBFFFBBFFFFFFFFFFFBBFFFF/FF<F7FF//F/FBB/FFBFFF/F7BFF<F/FFFFFFFFB/7BB<7BFFFFFFFFFFFFF<B///B/7B/7/B//77BB//7B/B7/B#
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:1903:2238/1
TATTCCAGCGACCGTTATAATCAAACTCAACTACATAGTCATTGCGGATTGCTTCAAGAAATTTTTTCCAGACTATTTCATCAATATTTATTTTGGGAACTGGTGCAACAGCAATTCTTTTTAAA
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFBFF/FFBFFBFFFFFFFF/FFFFFF<<FFFFFFFFFFFFFBFFFFFFFFFFFFFFFFFBF/B/<B<B/FBF7/<FFFFFFF/BB/7///7FF<BFFF//B/FFF###
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:1903:2238/2
TAAGGTTGGAGAAGCAACAATTTACCGTGATATTGATTTGCTCCGAACATATTTTCATGCGCCACTCGAGTTTGACAGGGAGAAAGGCGGGTATTATTATTTTAATGAAAAATGGGATTTTGCCC
+
B<BBBFFFFFFF<FFFFFFFFFFFFFFFFFF/BFFFFFFF<<FF<F<FFF/FF/FFFFBFB</<//<B/////<<FFFFB/<F<BFF/7/</7/7FB/B/BFF<//7BFF###############
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2107:2125/1
TGTAGTATTTATTACATCATATAGAATGTAGATATAAAAGATGAAAAAGCTATAATTTCTTTGATAATATAAGGAGGGAATAACACTATGAGGATTGATAGAGCAGGAATCGAGGATTTGCCGAT
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF<FFFFF/FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFBBBFFFFFFFBB<FBB7BFF#
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2107:2125/2
TACCACTATCGGCAAATCCTCGATTCCTGCTCTATCAATCCTCATAGTGTTATTCCCTCCTTATATTATCAAAGAAATTATAGCTTTTTCATCTTTTATATCTACATTCTATATGATGTAATAAA
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF<FFFFFFFFFFFFFBFBFFFFFFFBBFFFFFFFBF7F/B/BBF7/</FF/77F/77BB#
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2023:2224/1
TCACCAGCTCGGCACGCTTGTCCTTGACCTCCTGCTCGATCTGACCGTCCATCTTGGCTGCCACGGTGTTCTCCTCGGCGGAGTAGGCAAAGCAGCCCAGACGGTCGAACTGTATCTCCTTGACA
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF<FFFFFFFFFFFFB<<B7BBFBFFF<FFBBFFFBF/7B/<B<
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2023:2224/2
TCGAGGATCTGTGCAACTTTGTCAAGGAGATACAGTTCGACCGTCTGGGCTGCTTTGCCTACTCCGCCGAGGAGAACACCGTGGCAGCCAAGATGGACGGTCAGATCGAGCAGGAGGTCAAGGAC
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFBFFFFFFFFFBFBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFBBFFFFFFFFFFFFF<7BF/<<BB###
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2038:2235/1
TTTATGCGAATGTAGAGTGGCTTCTCCACTGCCTCGGTGAAGCCCACGCGCGAGATGAGCGAATTAAGCTGCTTTGCAGTGAATTGCATTGCATATACACCTGCGTCGGCTTGAATACTTGTGCT
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFBFFFFFFFFFFF//BFFFFFFFFFFFFF<B<BB###
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2038:2235/2
AATCCGCTCGTGAAAGCTCCCGATAACGCCACAGTGAACACCGTGGAGTTCTCTGATACCGAAGATTTCGCACGCAGCACAAGTATTCAAGCCGACGCAGGTGTATATGCAATGCAATTCACTGC
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFBBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2271:2041/1
NACACTTGTCGATGATCTTGCCAAGCTGCTTCTTGCCCACCAGGAAGCCGATCTCCAGATCAAACTCGTGGCCGGGAACACTCCGGTCCACAAAGCCCAGGTCCTGGGGAATGGGCTCATCGTAG
+
#<</BB/F/BB/F<FFFFFFFFF/<BFFFFFFFF<<FFBFFFFFFBFBFBBB<<FFFFBFFF/<B/FFFFFFFFFFFFFFFFF<FB<<BFF77BFFF/<BFFFB<</BB</7BFFFB########
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2271:2041/2
GACTCATCTACAATGAGCCCATTCCCCAGGACCTGGGCTTTGTGGACCGGAGTGTTCCCGGCCACGAGTTTGATCTGGAGATCGGCTTCCTGGTGGGCAAGAAGCAGCTTGGCAAGATCATCGCC
+
<<BBBFFF<F/BFFFBFBF<BFF<<F/FFFBFFFF<<FFFFBFFFFFFBFFF/<B<F/<</<FFF//FFFFF/<<F/B/B/7/FF<<FF/7B/BBB/7///7////<B/B/BB/B/B/B/7BB##

被拉出并放入自己的 .fastq 文件后的正向读取示例：

@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:1091:2161/1
GAGAAGCTCGTCCGGCTGGAGAATGTTGCGCTTGCGGTCCGGAGAGGACAGAAATTCGTTGATGTTAACGGTGCGCTCGCCGCGGACGCTCTTGATGGTGACGTCGGCGTTGAGCGTGACGCACG
+
B/</<//B<BFF<FFFFFF/BFFFFFFB<BFFF<B/7FFF7B/B/FF/F/<<F/FFBFFFBBFFFBFB/FF<BBB<B/B//BBFFFFFFF/B/FF/B77B//B7B7F/7F###############
--
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:1637:2053/1
NGTTTACCATACAACAATCTTGCGACCTATTCAAATCATCTATATGCCTTATCAAGTTTTCATAGCTTTCAAGATTCTCAATTTCCTCACGTCTCGCTTTGCTCAACCTACAAAAACTCTCTTCT
+
#<<BBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF<FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFB/BFBBFBB<<<<FFFFFFBB<FBFFBFF
--
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:1792:2218/1
TCTATCGGCTGACCGATAAGCTGTCGCCTGCCGACCGTCCTGCCATGGGACGGCGCATCGCACAGCTCACCCTGGACTAACTCTCCAACACCATGATGCTGACACGCTCGGCAAAAACACCCGAT
+
<<B/<B</FF/<B/<//F<//FF<<<FF//</7/F<</FFF####################################################################################
--
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:1903:2238/1
TATTCCAGCGACCGTTATAATCAAACTCAACTACATAGTCATTGCGGATTGCTTCAAGAAATTTTTTCCAGACTATTTCATCAATATTTATTTTGGGAACTGGTGCAACAGCAATTCTTTTTAAA
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFBFF/FFBFFBFFFFFFFF/FFFFFF<<FFFFFFFFFFFFFBFFFFFFFFFFFFFFFFFBF/B/<B<B/FBF7/<FFFFFFF/BB/7///7FF<BFFF//B/FFF###
--
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2107:2125/1
TGTAGTATTTATTACATCATATAGAATGTAGATATAAAAGATGAAAAAGCTATAATTTCTTTGATAATATAAGGAGGGAATAACACTATGAGGATTGATAGAGCAGGAATCGAGGATTTGCCGAT
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF<FFFFF/FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFBBBFFFFFFFBB<FBB7BFF#
--
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2023:2224/1
TCACCAGCTCGGCACGCTTGTCCTTGACCTCCTGCTCGATCTGACCGTCCATCTTGGCTGCCACGGTGTTCTCCTCGGCGGAGTAGGCAAAGCAGCCCAGACGGTCGAACTGTATCTCCTTGACA
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF<FFFFFFFFFFFFB<<B7BBFBFFF<FFBBFFFBF/7B/<B<
--
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2038:2235/1
TTTATGCGAATGTAGAGTGGCTTCTCCACTGCCTCGGTGAAGCCCACGCGCGAGATGAGCGAATTAAGCTGCTTTGCAGTGAATTGCATTGCATATACACCTGCGTCGGCTTGAATACTTGTGCT
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFBFFFFFFFFFFF//BFFFFFFFFFFFFF<B<BB###
--
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2271:2041/1
NACACTTGTCGATGATCTTGCCAAGCTGCTTCTTGCCCACCAGGAAGCCGATCTCCAGATCAAACTCGTGGCCGGGAACACTCCGGTCCACAAAGCCCAGGTCCTGGGGAATGGGCTCATCGTAG
+
#<</BB/F/BB/F<FFFFFFFFF/<BFFFFFFFF<<FFBFFFFFFBFBFBBB<<FFFFBFFF/<B/FFFFFFFFFFFFFFFFF<FB<<BFF77BFFF/<BFFFB<</BB</7BFFFB########
--
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2678:2145/1
CTGTACATAGTACGTATTTGACGCCTGCGTCGATGTAGCGTTTGAGGAAGGGAAGCAGCGGTTCTGCAGAGTCCTCTTTCCATCCGTTGATGCTAATCATTCCGTTGCGTACATCCGCTCCGAGA
+
BBBBBFFFFFFF<FFF<FFFFFFFFBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF<BFFF7BFFFFFFFF<BBFFFFFFFFBBFBBB<FFBFFFFFFFFFFFFB<BFFFFFFBFB/BFFF####
--
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2972:2114/1
CTCTGTGCCGATCCCTTTGCCTTTGCGTTTTGAGGAAAGGAAACCACCTTCTGGGTCGGTGAGGATAGTTCCGGTGAAGGTGTTGTCCACCGCCAGGCATAGGGAATAGCTGTCAGCCTTTGCTC
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFB/FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFBFFFFFFBFFFF<FFFFFFFFFF<BFFFFF
--
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:2940:2222/1
CTAATTTTTTCATTATATTACTAATTTTGTAATTGGTAAAATATTATAATATCCTTGTACATTAAGACCCCAATAATCAGAAGAAGTAAAATTAATTCCTGCAACAGTTCTTAAATATCCATTAG
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF<FBFFFFFFFFFFFFFFF/FBFBFFBFFFFF/<F<FFFFFFFFFF<FFFFFFBFFFFFFFFF</FBFBBF<F/7//FFBFBBFFF/<7BF#
--
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:3037:2180/1
CGTCAGTTCCGCAACGATAAAGAGTTCCGCATTGCAGTCACCTGTACGCTGGTAGCCACCGGAACCGATGTCAAGCCGTTGGAGGTGGTGATGTTCATGCGCGACGTAGCTTCCGAGCCGTTATA
+
B/BBBBBFFFFFFF<FFBFFFFFF<FFFFBFFFFFFF<BBFFFFFFFFFFFFFFFFFBFF/FFFFBFFBFFFFBFF/7F/BFB/BBFFFFFFFFBFF<BBF<7BBFFFFFFBBFFF/B#######
--
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:3334:2171/1
ACCGATGTACATACCCGGACGGGTACGCACATGCTCCATATCGCTCAAGTGGCGGATATTGTCATCTGTATATTCTACAGGTTGCTCCTGAGGGGTATTTGCCAGTTCTTCGGCAGCACCCTTTT
+
BBBBBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFBFFFFFFFFFFFFFFFBFFFFFFFFFFFBFFFFFFFFFF</<BFFFFFFFFBBFFFFFFBF</BB///BF<FFFFF<</<B
--
@HISEQ:534:CB14TANXX:4:1101:3452:2185/1
CGCAGACGGATTTGCTTGAAGTCCGTCTCATCGTATTCCGACAACTCATCGAGGAACACACGCTTGTATTGACTGATACCCTTGATTTTCTCCGGGTCGTCAAGACCACTGAAATCAATCTTGCC
+
BBBBBFFFF<FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF<FFFFFBFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFBFFFFFFFFFFBFFFFFBFFBFFFFFFFFFB/77B/FBBFFF/<FFF/77BBFFFBFFBBB
--

如有任何建议，我们将不胜感激。谢谢！

Answer 1

fastq 格式每次读取使用 4 行。您的代码段有 5 个，因为有 -- 行。这可能会对期望 4 行格式的软件造成混淆。您可以将 --no-group-separator 添加到 grep 调用中以避免添加该分隔符。

我通常按照这些步骤将 bam 转换为 fastq.gz

samtools bam2fq myBamfile.bam > myBamfile.fastq 

cat myBamfile.fastq | grep '^@.*/1$' -A 3 --no-group-separator > sample_1.fastq
cat myBamfile.fastq | grep '^@.*/2$' -A 3 --no-group-separator > sample_2.fastq 

gzip sample_1.fastq
gzip sample_1.fastq

获得这两个文件后，您应该对它们进行排序以确保读取真正配对。

Answer 2

一般来说，这个操作叫做deinterlace fastq或者deinterleave fastq。问题在这里已经有了答案：

去交织fastq文件 https://www.biostars.org/p/141256/

我将其复制到此处，为清楚起见稍作重新格式化：

paste - - - - - - - - < interleaved.fq \
    | tee >(cut -f 1-4 | tr "\t" "\n" > read1.fq) \
    |       cut -f 5-8 | tr "\t" "\n" > read2.fq

此命令将交错的 fastq 文件转换为 8 列的 tsv 文件，剪切第 1-4 列（读取 1 行），将 tsv 格式更改为 fastq 格式（通过用换行符替换制表符）并将输出重定向到 read1.fq。在相同的 STDOUT 流中（为了速度），使用 tee，它剪切第 5-8 列（读取 2 行）等，并将输出重定向到 read2.fq.

您还可以使用这些命令行工具:

iamdelf/deinterlace：将双端 FASTQ 文件去交错成第一链和第二链文件。 https://github.com/iamdelf/deinterlace

解交错 FASTQ 文件 https://gist.github.com/nathanhaigh/3521724

或带有 Galaxy web UI 的在线工具，例如此工具："FASTQ splitter on joined paired end reads"，安装在多个 public Galaxy 实例上，例如作为 https://usegalaxy.org/ .

如果可以使用行号，避免使用正则表达式 进行简单的 fastq 文件解析，这既是为了速度（模式匹配比简单计数慢）又是为了稳健性。

极不可能，但是像 ^@.*/1$ 这样的模式（或者 reader 可能将其更改为任何内容，同时稍后重用此代码）也可以匹配基本质量线。一个好的通用规则是简单地依赖 fastq 规范，它说每条记录 4 行。

请注意，Illumina Phred 分数中允许使用 @、/、1 和 2 个字符：https://support.illumina.com/help/BaseSpace_OLH_009008/Content/Source/Informatics/BS/QualityScoreEncoding_swBS.htm .

一个单行代码可以拉出这样的（诚然，非常罕见的）阅读作为练习留给 reader。

Answer 3

我们可以使用 Seqkit 拆分 FASTQ 文件。

seqkit split2 -p 2 sample21_pe.unmapped.fq

https://bioinf.shenwei.me/seqkit/usage/#split2 示例 4 将有助于解决此问题。

我不确定它是否识别读取的 ID。它拆分并交替写入第一个输出文件和第二个输出文件。

如何拆分双端fastq文件？

How to split paired-end fastq files?

grep

bioinformatics

samtools

fastq